Oleh :

Dwithree Desfajerin D., SP., MP.

PBT BBPPTP Surabaya

Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. DNA dapat diekstrak dari bahan biologis apapun seperti sebagai jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel lainnya untuk tujuan analisis. Isolasi/ekstraksi DNA dilakukan pertama kali oleh dokter Swiss, Friedrich Miescher pada tahun 1869 yang berharap memecahkan prinsip-prinsip dasar kehidupan, dan menentukan komposisi kimia sel. Dari percobaan yang dilakukan terhadap leukosit, untuk pertama kalinya diperoleh endapan kasar DNA. Untuk memisahkan DNA dari protein dalam ekstrak selnya, Miescher mengembangkan prosedur baru untuk memisahkan inti sel dari sitoplasma dan kemudian DNA diisolasi. Prosedur pertama gagal dan dikembangkan prosedur kedua yang mendapatkan nuclein murni dalam jumlah yang lebih besar, yang kemudian oleh muridnya, Richard Altman disebut sebagai asam nukleat (nucleic acid) (Tan dan Yiap, 2009).

Setelah Miescher berhasil memperoleh DNA dari sel, maka kemajuan metode ekstraksi dan prosedur pemurnian DNA telah berkembang. Telah ditemukan banyak metode khusus ekstraksi DNA yang umumnya terbagi dalam prosedur solution-based atau column-based. Tan dan Yiap (2009) mengemukaan bahwa jenis ekstraksi asam nukleat dibedakan jadi 2 yaitu :

1. Metode konvensional (Ekstraksi Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform; ekstraksi alkaline; ekstraksi CTAB; Ethidium Bromide (EtBr)-Cesium Chloride (CsCl) Gradient Centrifugation; Purification of Poly (A)⁺ RNA by Oligp(dT)-Cellulose Chromatography)
2. Ekstraksi solid-phase Nucleic Acid (Silica Matrices; Glass Particle; Diatomaceous Earth; Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification; dan Anion-Exchange Material).

Bahan tanaman merupakan salah satu bahan yang sulit untuk ekstraksi DNA kualitas tinggi. Kesulitan ekstraksi DNA tanaman adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel, karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat. Disamping itu DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Senyawa-senyawa tersebut dapat mengkontaminasi sediaan DNA dan akan menghambat analisis lebih lanjut.

Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam analisis molekuler. Oleh karena itu, masalah-masalah dalam ekstraksi DNA masih merupakan hal penting yang perlu diatasi. Beberapa teknik dan prosedur ekstraksi DNA telah dipublikasikan, tetapi seringkali tidak dapat diaplikasikan karena genus atau bahkan spesies tanaman bersifat sangat spesifik. Suatu metode standar perlu modifikasi dan optimalisasi untuk menghasilkan DNA berkualitas tinggi.

Romman (2011) telah melakukan perbandingan metode CTAB dengan berbagai modifikasinya pada tanaman Sage (Salvia officinalis). Pada protokol pertama, ekstraksi DNA didasarkan pada Doyle dan Doyle (1987). CTAB digunakan untuk memfasilitasi pemisahan protein dari asam nukleat dalam ekstraksi bahan biologis. Sedangkan tiga protokol lainnya merupakan modifikasi dari metode Doyle dan Doyle. Modifikasi ini termasuk penggunaan polivinilpirolidon (PVP) dikombinasikan dengan arang aktif (metode Krizman); menggabungkan isolasi berbasis CTAB dengan pemurnian berbasis kolom (metode Sarwat) dan termasuk perlakuan copper (II) acetate (metode Bokszczanin dan Prazybyla).

Tabel 1. Perbandingan kualitas dan hasil DNA dari berbagai macam metode DNA.

Sumber : Romman (2011).

Tabel 1 menunjukkan hasil dan kualitas DNA tanaman sage yang diisolasi menggunakan modifikasi metode isolasi DNA berbasis CTAB. Hasil dari tiga ekstraksi DNA menunjukkan bahwa protokol metode Krizman memberikan hasil DNA tertinggi dengan rata-rata 411 ± 15,7 µg DNA/g jaringan daun diikuti oleh metode Sarwat yang menghasilkan 257 ± 11,6 µg DNA/g jaringan daun. Kualitas DNA yang diisolasi dengan metode Krizman juga lebih baik daripada tiga protokol lain.

Metode CTAB tradisional (metode Doyle dan Doyle) menghasilkan DNA terendah dan kualitas yang buruk. Metode Krizman menghasilkan rasio absorbansi UV terbaik untuk kontaminasi protein (A_260/280) dan karbohidrat (A_260/230) (Tabel 1). Dimana untuk persiapan asam nukleat yang baik dan murni, rasio A_260/280 yang mewakili kontaminasi protein harus antara 1,8-2,0 sedangkan rasio A_260/230 yang merupakan kontaminasi karbohidrat harus >2,0 (Romman, 2011).

Romman (2011) menjelaskan bahwa penggabungan arang aktif dalam campuran ekstraksi Krizman sebelum sampel inkubasi meningkatkan kualitas dan hasil DNA serta memberikan peluang DNA untuk diamplifikasi. Kualitas DNA yang tinggi diharapkan mencegah interaksi ireversibel DNA dengan polifenol, ketika senyawa cytosol-borne muncul saat kontak arang aktif lebih awal dari DNA. Ada kemungkinan bahwa PVP memiliki pengaruh sinergis dalam pengikatan polifenol pada arang aktif. Hal ini terjadi saat pengunaan agent pengikat polyphenol, PVP harus memiliki interaksi yang kuat dengan arang aktif karena konfigurasi sp²-elektronik rantai karbon yang terakhir.

Dalam penelitian lain Sandip (2013) juga melakukan perbandingan berbagai protokol bagi tanaman Ammi majus yaitu protokol yang dijelaskan oleh Doyle dan Doyle berbasis CTAB (Protokol 1), Edward berbasis EDTA (Protokol 2), Kotchoni dan Gachomo berbasis SDS (Protokol 3) dan modifikasi Kotchoni dan Gachomo (Protokol 4). Hasil ekstraksi DNA dari empat protocol tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Perbandingan kemurnian, hasil, dan waktu yang diperlukan dalam ekstraksi DNA dengan protokol yang berbeda.

Sumber : Sandip (2013).

Tabel 2 menunjukkan bahwa protocol 4 memberikan kemurnian DNA yang paling tinggi dibanding protocol lainnya dimana rasio A_260/280 1,81. Pada Protokol 1 digunakan bahan kimia berbahaya CTAB dan EDTA dan waktu yang diperlukan paling tinggi dibanding yang lain. Hal tersebut menjadikan protokol 1 lebih mahal serta DNA yang terisolasi itu sangat terkontaminasi dengan protein menghasilkan rasio A_260/280 1.46. Protokol 2 merupakan salah satu protokol yang terkenal cepat dalam ekstraksi DNA, menjelaskan penggunaan buffer EDTA dan NaCl yang efisien waktu dan biaya, tetapi kontaminasi protein dengan rasio A_260/280 1,34. Tanpa EDTA dan Tris-HCl, protokol 3 memerlukan waktu lebih cepat tanpa harus menangani pelarut organik berbahaya. Namun protokol 3 gagal mengisolasi DNA murni tanpa protein dan kontaminasi polisakarida.

Dalam penelitian ini ditemukan bahwa protokol 2 dan 3 merupakan protokol yang cepat, efektif biaya dan lebih mudah tetapi gagal untuk mengisolasi DNA dengan kemurnian yang cukup dari A. majus dengan rasio A_260/280 (1,3-1,6). Modifikasi protokol 3 yaitu protokol 4 menunjukkan hasil terbaik untuk mengisolasi DNA dengan kemurnian dan kuantitas DNA tinggi dengan menggunakan kloroform : isoamil alkohol (24:1), isopropanol yang didinginkan dan tambahan waktu inkubasi untuk langkah ekstraksi buffer. Langkah-langkah tersebut menghasilkan penyempurnaan isolasi DNA murni dengan rasio A_260/280 1,81 dengan kuantitas DNA per gram sampel tertinggi. Protokol 4 menghasilkan DNA transparan tanpa kontaminasi RNA saat dielektroforesis pada gel agarosa, menunjukkan kemurnian tinggi.

Dengan berkembangnya analisis molekuler saat ini, sebagian besar prosedur ekstraksi DNA telah berkembang menjadi kit komersial yang mempermudah proses ekstraksi DNA tersebut. Beberapa kit komersial juga tersedia untuk mengekstrak DNA genom dari jaringan tanaman dengan kualitas yang memadai, tetapi hasil dari DNA yang dihasilkan dari kit komersial sering rendah. Selain itu, biaya dapat menjadi penghalang bagi laboratorium kecil.

Sebuah metode ekstraksi DNA efektif telah dikembangkan dengan menggabungkan metode CTAB tradisional dengan prosedur pemurnian menggunakan butiran silica-coated magnetic.Metode tersebut menghasilkan kuantitas dan kualitas DNA yang tinggi pada daun dan biji kering sorgum yang diliofilisasi (Tabel 3). Penggunaan metode ini meningkatkan hasil ekstraksi DNA rata-rata 30 kali lipat dengan kemurnian tinggi yang konsisten. Kit paling baik menghasilkan DNA total 3 µg per sampel daun dan kemurnian DNA rendah serta tidak konsisten seperti yang ditunjukkan oleh rasio variable OD_260νμ/OD_230νμ. DNA tidak terdeteksi diisolasi dari biji kering dengan menggunakan kit (Tabel 3). Sampel DNA 220-400 nm telah diamati pada Nanodrop NP-1000 untuk menguji kualitas DNA. Spektrum serapan DNA yang diekstraksi dari jaringan daun dan biji menyerupai spektrum DNA phage λ murni (Gambar 1) (Xin and Chen, 2012).

Untuk menguji apakah metode yang dikembangkan tersebut berlaku untuk jenis tanaman lainnya, penerapan metode ini juga diuji pada beberapa spesies tanaman lain yang tersedia. Hasil dan kualitas DNA genom pada beberapa sampel daun tanaman tersebut disajikan dalam Tabel 4.

Tabel 3. Perbandingan hasil dan kualitas DNA antara kit MagAttract dengan metode perbaikan.

Sumber : Xin and Chen (2012).

Gambar 1. Spektrum serapan DNA yang diisolasi dari daun dan biji kering sorgum liofilisasi. DNA diisolasi dari daun atau biji yang diencerkan sampai 500 ng/µl dengan TE

dan discan pada NanoDrop 220-400 nm (Xin and Chen, 2012).

Optimasi dan modifikasi metode ekstraksi DNA akan terus berkembang sejalan dengan perkembangan metode ekstraksi DNA itu sendiri. Hal tersebut dilakukan untuk mendapatkan kuantitas dan kualitas DNA yang tinggi sehingga akan mendukung analisis lebih lanjut. Selain itu upaya tersebut dilakukan untuk alasan mengurangi waktu kerja, tenaga kerja, dan biaya serta meningkatkan keselamatan pekerja. Perbaikan kelemahan untuk instrumen-instrumen metode ekstraksi DNA perlu dilakukan sepanjang waktu sehingga akan ditemukan suatu metode yang cepat, tepat, murah, dan menghasilkan kuantitas dan kualitas yang tinggi.

Tabel 4. Hasil dan kualitas DNA genom yang diisolasi dari berbagai spesies tanaman.

Sumber : Xin and Chen (2012).

DAFTAR PUSTAKA

Romman, S.A. 2011. Comparison of methods for isolating high quality DNA from sage (Salvia officinalis). J. Med. Plant Res. 5(6):938-941. Available online at https://www.academicjournals.org/JMPR.

Sandip, M. 2013. A reliable and high yielding method for isolation of genomic DNA from Ammi majus. Int. Res. J. Biological Sci. 2(1) : 57-60.

Tan, S.C. and B.C. Yiap. 2009. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. Review Article. Journal of Biomedicine and Biotechnology. pp. 1-10. doi:10.1155/2009/ 574398.

Xin, Z. and J. Chen. 2012. A high throughput DNA extraction method with high yield and quality. Plant Methods. 8:26. https://www.plantmethods.com/content/8/1/26.